Создание системы экспрессии гена колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) млекопитающих в бактериальных клетках : отчет о научно-исследовательской работе (заключительный) / БГУ ; научный руководитель В. А. Прокулевич

Abstract

Объектами исследования являлись ген и белок бычьего гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ). Цели проекта: разработка и получение устойчивой генетической конструкции, несущей ген цитокина ГМ-КСФ, в составе стабильно наследуемой векторной системы бактерий; разработка дизайна и клонирование гена ГМ-КСФ в клетках E.coli, получение белка ГМ-КСФ и анализ особенностей экспрессии генетической конструкции в E. coli; изучение основных свойств белка, включая его активность. Методы исследования: микробиологические, генетические, биохимические, биоинформатические и молекулярно-биологические. В процессе исследований использованы следующие приборы: амплификатор, автоматический секвенатор, весы лабораторные аналитические, центрифуги, термостаты, холодильники, сушильные шкафы, автоклав, качалки, водяные бани, аппараты для электрофореза, магнитные мешалки, система гельдокументации, СО2-инкубатор, ламинарный шкаф, хроматограф, микроскоп, система фильтрации в тангенциальном потоке. В результате работы проведен сравнительный молекулярно-генетический и эволюционный анализ белковых и нуклеотидных последовательностей бычьего ГМ-КСФ, определены элементы гомологии, а также вариабельные участки и эволюционные дистанции. Сконструирована последовательность структурной части гена бычьего ГМ-КСФ, оптимизированная для экспрессии в клетках E. coli. Рассчитан индекс адаптации кодонов для гена бычьего ГМ-КСФ. Оптимизированная последовательность гена отсеквенирована, проведена амплификация методом ПЦР, после чего последовательность клонировали в составе вектора pET24b(+) по сайтам рестриктаз Nde I и Eco RI. Полученной конструкцией трансформированы клетки штамма E. coli XL-1 Blue. Отобраны клоны, унаследовавшие рекомбинантные плазмиды с геном бычьего ГМ-КСФ. Установлено, что созданная генетическая конструкция экспрессируется в гетерологичном хозяине E. coli. Биосинтез целевого белка приводит к его накоплению в «тельцах включения». Разработаны методики рефолдинга и очистки ГМ-КСФ из бактериальных клеток, а также методика оценки его биологической активности.