Усовершенствование рекомбинантного штамма бактерий Bacillus subtilis – продуцента альфа-амилазы (3.12) : отчет о научно-исследовательской работе (заключительный) / БГУ ; научный руководитель А. В. Качан

Abstract

Объектом исследования являлись нуклеотидные последовательности, детерминирующие синтез α-амилазы в клетках бактерий рода Bacillus. Цель НИР - повышение уровня синтеза α-амилазы рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis. Работа была выполнена с использованием методов микробиологии, биохимии, молекулярной генетики. Показано, что ген amyM3, кодирующий рекомбинантную α-амилазу Bacillus flexus, подвергается катаболитной репрессии в клетках Bacillus subtilis, при этом белок катаболитного контроля CcрA, регулирующий экспрессию большинства генов, подверженных катаболитной репрессии в клетках B. subtilis, не оказывает существенного влияния на глюкозную репрессию гена α-амилазы. С целью повышения уровня синтеза молекулярного шаперона PrsA, участвующего в фолдинге α-амилазы в клетках B. subtilis, в работе создан рекомбинантный штамм B. subtilis, содержащий хромосомную инсерцию химерного гена prsA под контролем конститутивного промотора РP43. Измерение амилолитической активности в полученном штамме показало, что замена промоторной области в гене prsA не вызывает статистически значимого прироста синтеза α-амилазы. В резульате получен бирепликонный вектор-“ловушка” pALPT 5 и разработана методика поиска сильных промоторных последовательностей в клетках B. subtilis. Используя вектор pALPT-5, было отобрано 36 фрагментов ДНК различных бактерий рода Bacillus, обеспечивавших повышенную экспрессию гена α-амилазы, из них 5 последовательностей обеспечивали более чем 35-кратное повышение активности фермента. При культивировании в среде СКМ бактерии, содержащие одну из отобранных плазмид pALPT-1/2, обеспечивали накопление α-амилазы в количестве 1745,5 ед./мл. Показано, что внесение в питательную среду СКМ мелассы и глюкозы оказывает негативный эффект на биосинтез α-амилазы при ферментации. Проанализированы условия, при которых неочищенный препарат α-амилазы АmyM3 обеспечивает эффективное разжижжение картофельного крахмала; подобраны параметры реакции, обеспечивающие гидролиз 12,6-13,23 % гликозидных связей при температурах 60, 70 и 80 °С.