Рефолдинг и очистка рекомбинонтного эктодомена рецептора эфрина А5 методом гель-фильтрации

Abstract

Генетическая последовательность эктодомена рецептора EphА5, клонированная в плазмиду pEX32, экспрессировалась вместе с тиоредоксиновым фрагментом в штамме E.coli Origami B (DE3) в виде телец включения. Белок из телец включения солюбилизировали в растворе 8 моль/л мочевины и подвергали рефолдингу используя метод гель-фильтрации на Sephacryl S300. Данный метод позволяет использовать высокую исходную концентрацию белка (10 мг/мл) и эффективно проводить рефолдинг с одновременным отделением целевого продукта от высокомолекулярных белковых агрегатов, в тоже время, обеспечивая необходимые условия для рефолдинга: пространственную изоляцию белковых молекул друг от друга в порах сорбента и плавное снижение концентрации денатурирующего агента (мочевины). Электрофоретический анализ полученных фракций в неденатурирующих условиях продемонстрировал наличие мономерной формы эктодомена рецептора EphА5. Тиoредоксиновый фрагмент и эктодомен EphA5, полученные после протеолиза тромбином разделяли хроматографически используя Sephadex G-100. Описанная технология позволяет провести рефолдинг и получить мономерный EphA5 с чистотой не менее 90%, используя исключительно методы гель-фильтрации.