Получение инсулин-продуцирующих мезенхимальных стволовых клеток человека путем генетической модификации : отчет о научно-исследовательской работе (заключительный) / руководитель темы В. В. Гринев

Abstract

Объект исследования: лентивирусные векторы для переноса тканеспецифических генов поджелудочной железы в МСК человека. Цель исследования: получить инсулин-продуцирующие мезенхимальные стволовые клетки человека путем генетической модификации. Методы исследования: выделение, рестрикция, лигирование, секвенирование и электрофорез нуклеиновых кислот, полимеразная цепная реакция (ПЦР), трансформация бактерий, получение рекомбинантных лентивирусов, получение и культивирование МСК, лентивирусная трансдукция, проточная цитометрия, вестерн-блоттинг. Использованные приборы: cпектрофотометр Cary 50, термоциклер ThermoHybaid Px2, секвенатор ALFexpressTM II, амплификатор Chromo4, система для белкового гель-электрофореза Mini-Protean® Tetra Cell, система для белкового переноса Mini Trans-Blot® Electrophoretic Transfer Cell, проточный цитофлуориметр FACScan. Основные результаты: В результате проведенной работы получены кДНК генов тканеспецифичных транскрипционных факторов бета-клеток поджелудочной железы PDX1 и NEUROG1. Эти гены использованы для клонирования в составе векторов pHR-Pdx1 и pHR-NEUROG3, которые использованы для получения трансдуцирующих рекомбинантных трансдуцирующих лентивирусных частиц. Была проведена трансдукция мезенхимальных клеток костного мозга (МСК КМ) человека и анализ индуцируемых генной модификацией изменений в характере экспрессии других тканеспецифических генов. Результаты анализов указывают на невысокий уровень индуцируемой дифференцировки клеток при использовании данного подхода и невозможность получения при данном подходе глюкозорегулируемой экспрессии аутологичного гена инсулина. Также были разработаны и сконструированы вектора pHR-PEgr1-PPI, pHR- PEgr1-SCI и pHR-PEgr1-Fur_PPI, использованые для получения трансдуцирующих рекомбинантных лентивирусных частиц для переноса в МСК КМ человека гена природного инсулина человека либо его модифицированных вариантов под контролем глюкозорегулируемого промотора гена Egr1 человека. После трансдукции в генномодифицированных клетках наблюдалась экспрессия гена инсулина, причем количество транскриптов гена быстро повышалось в 4-5 раз при добавлении в среду повышенной концентрации глюкозы, а затем постепенно снижалась до исходного уровня в течение 30 мин. Области применения: клеточная молекулярная биология, экспериментальная генная терапия, трансплантология.