Оценка эффективности инактивации шикиматкиназы у рекомбинантных штаммов – продуцентов шикимовой кислоты Вacillus subtilis 168wt21СSA и В. subtilis 5434p4SA

Abstract

Прототрофные штаммы Вacillus subtilis 168wt и В. subtilis ВКПМ 5434 трансформированы рекомбинантными конструкциями, содержащими фрагмент гена шикиматкиназы. За счет гомологичной рекомбинации осуществлена интеграция векторных конструкций в состав бактериальной хромосомы трансформируемых штаммов с образованием рекомбинантных штаммов В. subtilis 168wt21СSA и В. subtilis 5434p4SA. Конструктивные отличия между полученными штаммами обусловлены механизмом инактивации гена шикиматкиназы: при использовании конструкции pMTL21CΔaroK (штамм В. subtilis 168wt21СSA) реализована необратимая инактивация, а при использовании конструкции pMUTIN4ΔaroK (штамм В. subtilis 5434p4SA) – регулируемая (индуцируемая ИПТГ) экспрессия гена шикиматкиназы. Изучены морфофизиологические и биохимические особенности штаммов В. subtilis 168wt21СSA и В. subtilis 5434p4SA. У обоих штаммов в нативных условиях отмечены утрата прототрофных свойств и приобретение способности к повышенному синтезу шикимовой кислоты. Для штамма B. subtilis 5434p4SA продемонстрирован эффект восстановления прототрофных свойств у части клеток бактериальной популяции при активации экспрессии гена шикиматкиназы в присутствии ИПТГ. Выявлена зависимость изменения числа клеток с активированным геном шикиматкиназы от концентрации индуктора в среде. С применением метода ВЭЖХ показано, что у полученных штаммов-кандидатов шикимовая кислота синтезируется эффективнее, чем у соответствующих штаммов-предшественников: ее содержание в культуральной среде может достигать 564 мкг/мл для штамма В. subtilis 168wt21СSA и 732 мкг/мл для штамма В. subtilis 5434p4SA, т. е. более чем в 2,5 раза превышать таковые значения для исходных штаммов.