Получение и характеристика мутантов Erwinia amylovora по генам ключевых транскрипционных регуляторов : отчет о научно-исследовательской работе (заключительный) / БГУ ; научный руководитель А. Л. Лагоненко

Abstract

Объектами исследования являлись фитопатогенные бактерии Erwinia amylovora. Цель работы – выявление в геноме бактерий Erwinia amylovora генов новых транскрипционных регуляторов факторов вирулентности, их инактивация и последующая характеристика полученных мутантов. НИР была выполнена с использованием методов микробиологии, биохимии, молекулярной генетики. В ходе выполнения осуществлен анализ геномной последовательности бактерии Erwinia amylovora Е2 с целью выявить гены, кодирующие неизученные транскрипционные регуляторы, потенциально связанные с факторами патогенности. Найдены четыре гена, кодируюцие регуляторы MarR-семейства: mprA, marR, ohrR, slyA. С помощью программ SigmoID и STRING были предсказаны регулоны для этих транскрипционных факторов. Наиболее разнообразным оказался предсказанный регулон SlyA, состоящий из генов, кодирующих белки внешней мембраны и периплазмы, секретируемые белки, вовлеченные в процесс патогенеза, определяющие устойчивость к антимикробным пептидам и активным формам кислорода. Вышеназванные гены были амплифицированы в ходе ПЦР и клонированы в векторах pUC18 и pFLAG-CTC. Получены делеционные мутанты по выявленным генам. Созданы репортерные конструкции с их регуляторными последовательностями на основе вектора pUA66. Была осуществлена фенотипическая характеристика полученных мутантов. Показано, что инактивация генов slyA, marR, mprA и ohrR не оказывает влияние на подвижность клеток бактерий. Однако, сверхэкспрессия регулятора SlyА в клетках Erwinia amylovora значительно снижает, а MprA повышает их подвижность. У делеционного мутанта по гену slyA снижается продукция экзополисахарида амиловорана, устойчивость к окислительному стрессу и способность к формированию биопленок. Инактивация изучаемых генов не оказывает влияния на способность клеток Erwinia amylovora вызывать реакцию гиперчувствительности. Было показано, что продукты генов slyA, marR и ohrR играют важную роль в вирулентности бактерий Erwinia amylovora по отношению к вегетирующим растениям груши. Полученные в ходе работы репортерные конструкции, содержащие промоторные последовательности генов транскрипционных регуляторов MarR-семейства, могут быть использованы для поиска защитных препаратов, подавляющих экспрессиию факторов вирулентности бактерий Erwinia amylovora.