Цитокины как регуляторные элементы репродуктивной функции крупного рогатого скота, 1.21 : отчет о научно-исследовательской работе (заключительный) / БГУ ; научный руководитель В. А. Прокулевич

Abstract

Объектами исследования являлись ген и белок бычьего тау-интерферона. Цели работы: создание устойчивых генетических конструкций, кодирующих ген гормоноподобного цитокина ИФН-тау, в составе стабильно наследуемых векторных систем бактерий; клонирование гена ИФН-тау в бактериях E. coli; создание системы экспрессии гена и получение нативного белка ИФН-тау в составе химерных белков в E. сoli; разработка методики рефолдинга и очистки рекомбинантного белка; разработка системы анализа активности рекомбинантного белка и определение его основных свойств, включая удельную активность. Методы проекта: микробиологические, генетические, биохимические и молекулярно-биологические. В процессе исследования были использованы следующие приборы: амплификатор, автоматический секвенатор, весы лабораторные аналитические, центрифуги, термостаты, холодильники, сушильные шкафы, автоклав, качалки, водяные бани, хроматограф, аппараты для электрофореза, магнитные мешалки, СО2-инкубатор, инвертированный микроскоп, система гельдокументации. В результате проведен сравнительный молекулярно-генетический и эволюционный анализ белковых и нуклеотидных последовательностей бычьего ИФН-тау, определены элементы гомологии, а также вариабельные участки, определены эволюционные дистанции; сконструирована последовательность структурной части гена бычьего тау-интерферона, оптимизированная для экспрессии в клетках E. coli; рассчитан индекс адаптации кодонов для гена бычьего ИФН-тау; структурная часть гена бычьего ИФН-тау клонирована в клетках E. coli; отобраны клоны, унаследовавшие рекомбинантные плазмиды с геном бычьего ИФН-тау; по аминокислотной последовательности спрогнозированы свойства белка бычьего ИФН-тау; экспрессионной конструкцией трансформирован штамм E. coli BL21CodonPlus(DE3)-RIPL; после индукции в клетках бактерий E. coli BL21CodonPlus(DE3)-RIPL-pET24-cowIFN-τ происходит существенное накопление белка, соответствующего по размеру белку бычьего интерферона-τ (около 20 кДа). В то же время данный белок не образуется в клетках сконструированного штамма, выращенного в отсутствие ИПТГ. Белок бычьего ИФН-τ в ходе индуцибельной экспрессии в клетках E. coli BL21CodonPlus(DE3)-RIPL накапливается в тельцах включения. Получен тау-ИФН с полигистидиновой меткой на С-конце молекулы, который отличается в электрофоретической подвижности от нативного белка; разработана лабораторная технология очистки бычьего рекомбинантного ИФН-тау; разработана система анализа активности; подлинность рекомбинантного белка подтверждена с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, а также с помощью ВЭЖХ; была определена чистота рекомбинантного тау-ИФН, которая составила >99 %; получена и охарактеризована субстанция высокоочищенного рекомбинантного тау-ИФН, обладающего высокой специфической активностью, которая может использоваться как основа для создания инновационных ветеринарных препаратов.