Создание продуцента глюкоамилазы на основе Aspergillus awamori с помощью генно-инженерных технологий : отчет о научно-исследовательской работе (заключительный) / БГУ ; научный руководитель А. Н. Евтушенков

Abstract

Объектом исследования являются штаммы мицелиальных грибов Aspergillus awamori. Цель работы: создание продуцента технического фермента глюкоамилазы мицелиального гриба A. awamori с помощью генно-инженерных технологий. Методы, методология проведения работы: культивирование мицелиального гриба A. awamori и бактерий Escherichia coli, молекулярно-генетические методы исследования, ПЦР, секвенирование, трансформация протопластов, определение глюкоамилазной активности. В результате работы методом ПЦР с использованием специально сконструированных праймеров проведена амплификация фрагмента хромосомной ДНК, содержащего ген глюкоамилазы A. awamori. Осуществлено клонирование полученного ПЦР-продукта в векторе pUC19 в E. coli XL1-Blue. Охарактеризована нуклеотидная последовательность клонированной области. Сравнительный анализ показал, что искомый фрагмент ДНК проявляет высокую степень гомологии (99 %) с геном глюкоамилазы других штаммов A. awamori и штаммов A. niger. Для введения дополнительных копий гена глюкоамилазы создана генетическая конструкция pH4Hyg-glaA, с помощью которой произведена трансформация протопластов A. awamori 1/3а. Осуществлен отбор клонов с повышенной продукцией фермента по сравнению с исходным штаммом. Генно-инженерный штамм A. awamori 1/3а-1 обладает глюкоамилазной активностью, уровень которой после 120 ч культивирования с активным перемешиванием при 28 оС в среде, содержащей 24 % ржаной муки, обработанной ячменным солодовым молоком, составлял (292,4±24,2) ед./мл. Проведена оптимизация состава питательной среды и условий культивирования генно-инженерного штамма A. awamori 1/3а-1, которые бы обеспечивали максимальную продукцию фермента глюкоамилазы.