Экспрессионные векторные системы для молекулярно-генетической диагностики полициклических ароматических углеводородов в окружающей среде : отчет о научно-исследовательской работе (заключительный) / научный руководитель М. А. Титок

Abstract

Объект исследования: плазмида биодеградации капролактама (pBS267) группы IncP-9 бактерий Pseudomonas. Цель задания: изучить свойства мини-репликонов плазмиды pBS267 γ-подгруппы IncP-9, содержащих единичные мутационные изменения в области rep-гена и oriV-сайта для создания на основе многокопийного, стабильно наследующегося варианта тест-системы определения полициклических ароматических углеводородов в окружающей среде. Методы исследования: микробиологические (культивирование микроорганизмов), генетические (трансформация, конъюгация) и молекулярно-генетические методы (выделение ДНК, полимеразная цепная реакция, полимеразная цепная реакция «в реальном времени», «перекрывающаяся» полимеразная цепная реакция, рестрикционный анализ, клонирование, секвенирование). В процессе исследований были использованы следующие приборы: аппарат для гель-электрофореза, аппарат для анализа гелей, аппарат для полимеразной цепной реакции, аппарат для полимеразной цепной реакции «в реальном времени», автоматический секвенатор ALFexpress II, весы лабораторные аналитические, центрифуги, термостаты, холодильники, сушильные шкафы, автоклав, качалки, водяные бани. В результате исследования с использованием генно-инженерных манипуляций (в частности, «перекрывающейся» ПЦР, ПЦР «в реальном времени», клонирования, рестрикционного и сиквенс-анализа) изучены свойства мутантных репликонов плазмиды рBS267 γ-подгруппы группы IncP-9. Установлено, что мутационные изменения в области rep-гена, приводящие к замене 39 и 127 аминокислоты (аланин на треонин) обеспечивают увеличение копийности (в 40 раз) и стабильности наследования (в 10-100 раз) в бактериях рода Pseudomonas (P. putida, P. fluorescens, P. pseudoalcalidenes, P. stutzeri, P. chlororaphis, P. palleronii, P. aureofaciens, P. caryophylli, P. aurantiaca). На основе данного мутантного варианта сконструирован вектор для молекулярного клонирования (pKMS333). В созданный вектор встроена экспрессионная кассета, содержащая ген nahR с промотором гена nahG, обеспечивающим транскрипцию репортерного гена gfp в присутствии полициклических ароматических углеводородов, а также ген хемотаксиса nahY, обеспечивающий движение клеток по направлению к поллютантам (конструкция обозначена как pAST). Показана возможность использования бактерий Pseudomonas sp.10N-1, содержащих плазмиду pAST в качестве тест-системы для обнаружения полициклического ароматического углеводорода нафталина в окружающей среде (в частности, выявлено свечение бактерий, содержащих плазмиду pAST, под действием ультрафиолета в присутствии нафталина).