Создать генно-инженерный штамм–продуцент молочной кислоты. Межгосударственная целевая программа Евразийского экономического сообщества «Инновационные биотехнологии» на 2011-2015 гг., подпрограмма 1 «Инновационные биотехнологии в Республике Беларусь», задание 2.12 «Создать высокоэффективный штамм-продуцент молочной кислоты с целью усовершенствования технологии ее производства» : отчет о научно-исследовательской работе (заключительный) / БГУ ; научный руководитель Н. П. Максимова

Abstract

Объект исследования: молочнокислые бактерии представители родов Lactobacillus и Enterococcus. Цель задания: подобрать условия для трансформации (электропорации) молочнокислых бактерий; отработать методические подходы для выделения нуклеиновых кислот из молочнокислых бактерий и их анализа; получить гены лактатдегидрогеназ исследуемых штаммов, осуществить их анализ; изучить характер наследования плазмид в клетках молочнокислых бактерий: определить сегрегационную и структурную стабильность плазмид в рекомбинантных штаммах. Методы исследования: микробиологические – культивирование микроорганизмов, изучение кинетики роста и интенсивности роста при различных условиях, определение спектра и уровня антибиотикорезистентности; молекулярно-генетические: электропорация, выделение и очистка ДНК, рестрикция, электрофоретический анализ, ПЦР. В процессе НИР были использованы следующие приборы: аппарат для гель-электрофореза, аппарат для анализа гелей, весы лабораторные аналитические, центрифуги, термостаты для культивирования микроорганизмов, холодильники (морозильники), сушильные шкафы, автоклав, водяные бани, ПЦР-амплификаторы. В результате проведенной работы в клетках штамма L. casei БИМ В-194 была выявлена крупная аборигенная плазмида размером более 50 т. п. н. Подобраны условия для культивирования и электропорирования клеток штаммов L. casei БИМ В-194 и E. faecalis БИМ В-1012. Осуществлен анализ наследования различных векторных молекул в клетках указанных штаммов. Продукты амплификации генов лактатдегидрогеназы интактного и мутагенизированных вариантов штамма E. faecalis БИМ В-1012 были верифицированы посредством ПЦР-ПДРФ анализа. Для гена ЛДГ1 выявлено новое аллельное состояние гена, характеризующееся отличным электрофоретическим профилем при использовании рестриктаз MluI и SspI. Осуществлен сиквенс-анализ генов лактатдегидрогеназы 2-го типа мутантных вариантов штамма E. faecalis БИМ В-1012. Для клонирования генов лактатдегидрогеназ были использованы векторные конструкции pJIM2279 и pSWEET-bgaB. Определены условия хранения отобранного штамма, обеспечивающие сохранность определяющей его свойства плазмидной конструкции до 40 суток при температуре хранения 6-12 о С. Для наработки опытной партии L-молочной кислоты осуществлено глубинное культивирование бактерий в колбах объемом 2,0 л при 37 о С. Культуральная жидкость была использована для определения количества L-лактата.