Изучение особенностей экспрессии гена α-интерферона сельскохозяйственных животных в различных бактериальных системах вектор-хозяин : отчет о научно-исследовательской работе (заключительный) / БГУ ; научный руководитель В. А. Прокулевич

Abstract

Объектом исследований являлся ген куриного лейкоцитарного α-интерферона и различные грамотрицательные и грамположительные бактерии, в которых предполагается осуществлять экспрессию указанного гена. Цель работы: клонирование структурной части гена куриного лейкоцитарного α-интерферона в составе векторов для экспрессии в Escherichia coli, а также в клетках других грамотрицательных бактерий, отличающихся от E. coli; оценка экспрессии указанного гена в клетках грамотрицательных бактерий; создание конструкций для экспрессии гена куриного α-интерферона в клетках грамположительных бактерий, введение их в бактериальные клетки и изучение экспрессии целевого гена; изучение основных параметров экспрессии гена альфа-интерферона животных и возможные пути повышения ее эффективности. Методы исследования: микробиологические, генетические, биохимические и молекулярно-биологические. В процессе исследований были использованы следующие приборы: аппараты для вертикального и горизонтального гель-электрофореза, амплификатор, автоматический секвенатор, весы лабораторные аналитические, центрифуги, термостаты, холодильники, сушильные шкафы, автоклав, качалки, водяные бани, перистальтический насос, спектрофотометр. В результате работы структурная часть гена куриного альфа-интерферона амплифицирована с использованием сконструированных специфических праймеров и клонирована в клетках E. coli. Определена гомология последовательности, кодирующей куриный α-интерферон, с α-интерферонами других с/х животных и человека. Создана конструкция для конститутивной экспрессии гена куриного альфа-интерферона в клетках грамотрицательных бактерий. Проведена сравнительная оценка экспрессии гена куриного альфа-интерферона в клетках грамотрицательных бактерий. При этом наибольшее накопление целевого продукта наблюдается в клетках штамма Pseudomonas putida PPT2-около 17-20 % от общего клеточного белка. Установлено, что при периодическом культивировании грамотрицательных бактерий с геном куриного альфа-интерферона наиболее эффективно производить индукцию путем добавления ИПТГ в среду культивирования не позднее, чем за 2,5-3,0 ч до выхода культуры на стационарную фазу роста. Накопление биомассы грамотрицательных бактерий с геном куриного альфа-интерферона в среде TB происходит несколько быстрее, чем на среде LB, так как ТВ-среда является более богатой, однако по истечении 4 ч оптическая плотность культур, выращенных на разных средах, отличается незначительно. С использованием праймеров BSF1 и BSR1 амплифицирована последовательность гена куриного α-интерферона вместе с последовательностью RBS, характерной для Bacillus subtilis. В клетках бактерий E. coli XL-1 Blue клонирована конструкция, имеющая в своем составе RBS, spac-промотор, ген куриного α-интерферона и ген устойчивости к хлорамфениколу (pSC23-chickIFNα). Выявлена экспрессия гена куриного α-интерферона, находящегося под контролем spac-промотора в составе вектора pWIDA, в клетках E. coli XL-1 Blue. Конструкция pWIDA с геном куриного альфа-интерферона передана в клетки грамположительных бактерий B. subtilis. Получен штамм, названный B. subtilis 2WIDA, с интегрированным в его хромосому вектором pWIDA, содержащем ген куриного α-интерферона под контролем spac-промотора. При определении продукции белка куриного α-интерферона в клетках штамма B. subtilis 2WIDA с помощью иммуноблоттинга не выявлено наличия в клетках, либо в культуральной жидкости, белков с молекулярной массой 19 кДа, которые специфически связывались бы с антителами к белку куриного α-интерферона. Причиной этому может служить недостаточно высокий уровень экспрессии гена куриного интерферона-α или же разрушение белкового продукта протеазами, которыми богаты штаммы B. subtilis.