Разработка и функциональные испытания библиотеки лентивирусных векторов доставки, кодирующих анти-AML1/ETO короткие шпилечные РНК : отчет о научно-исследовательской работе (заключительный) / научный руководитель В. В. Гринев

Abstract

Объект исследования: функциональная роль РНК-транскриптов гибридного онкогена

AML1/ETO человека при ОМЛ, положительном по транслокации t(8;21)(q22;q22). Цель исследования: разработать и испытать в функциональных исследованиях библиотеку

лентивирусных векторов доставки, кодирующих кшРНК, направленных против полного

спектра мРНК гибридного онкогена AML1/ETO в клетках ОМЛ человека, положительных по

транслокации t(8;21)(q22;q22). Методы исследования: биоинформационный анализ и моделирование, выделение и

очистка плазмидных векторов, клонирование, секвенирование, получение рекомбинантных

лентивирусов, трансдукция, проточная цитометрия, ПЦР в реальном времени, вестерн-

блоттинг, клоногенный тест, дифференцировочный тест. Использованные приборы: персональный компьютер HP Pavilion dv9700 Notebook с двумя

операционными системами Windows VistaTM Home Premium и Ubuntu 9.04,

микроцентрифуга Biofuge fresco, спектрофотометр Cary50, термоциклер ThermoHybaid,

секвенатор ABI PRISM 3130, проточный цитофлуориметр FACScan. Основные результаты: Построена биоинформационная модель гибридного онкогена

AML1/ETO. Разработана библиотека лентивирусных векторов доставки, кодирующих

кшРНК, распознающие двадцать вариантов РНК-транскриптов, ассоциированных с транслокацией t(8;21)(q22;q22) и гибридным

онкогеном AML1/ETO. Получены рекомбинантные лентивирусы на основе лентивирусных

векторов доставки серии pLVTHM-shRNA. Проведена стабильная генетическая

модификации клеток ОМЛ путем лентивирусной трансдукции. Установлено, что РНК-

интерференция, запускаемая наработкой в генетически модифицированных лейкозных

клетках кшРНК, позволяет надежно и специфично контролировать экспрессию в этих

клетках целевых форм РНК, а также белков гибридного онкогена AML1/ETO. Показано, что нок-даун специфических форм РНК гибридного онкогена AML1/ETO не повышает частоту

апоптоза клеток ОМЛ, содержащих транслокацию t(8;21)(q22;q22). Обнаружено, что

элиминация с помощью РНК-интерференции РНК-продуктов, терминирующихся в области

3’UTR-экзонов 15а/9а, 17а/11а и 17, но не 3’UTR-экзона 12а/6а от гена ETO, приводит к

снижению клоногенности и индукции миелоидной дифференцировки лейкозных клеток. Области применения: клеточная и молекулярная биология, экспериментальная генная

терапия, онкогематология.