Взаимная регуляция генов RUNX1 и RUNX1/RUNX1T1 : отчет о научно-исследовательской работе (заключительный) / научный руководитель Т. В. Романовская

Abstract

Объект исследования: ген RUNX1 и гибридный ген RUNX1/RUNX1T1, экспрессирующийся в модельной клеточной линии Kasumi-1 и являющийся характерным маркером клеток острого миелоидного лейкоза. Цель работы: оценить взаимное регуляторное влияние продуктов гена RUNX1 и гибридного онкогена RUNX1/RUNX1T1 в клетках ОМЛ. Основные методы исследования: полимеразная цепная реакция, рестрикционная порезка и лигирование ДНК, электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле, трансформация, выделение и очистка плазмидной ДНК бактерий, методы культивирования бактериальных культур и культуры клеток человека, трансфекция, трансдукция, проточная цитофлуориметрия, количественная ПЦР, вестерн блоттинг, методы математического и статистического анализа данных. Оборудование: ламинарный шкаф HERAsafe (Heraeus, Германия); цитоцентрифуга (Beckman, США); CO2-инкубатор; световой микроскоп (Zeiss, Германия); инвертированный микроскоп (Zeiss, Германия); микроцентрифуга Biofuge fresco (Heraeus, Германия); система для ДНК гель-электрофореза (Bio-Rad, США); cпектрофотометр Cary 50, термоциклер ThermoHybaid Px2, секвенатор ALFexpressTM II, амплификатор Chromo4, система для белкового гель-электрофореза Mini-Protean® Tetra Cell, система для белкового переноса Mini Trans-Blot® Electrophoretic Transfer Cell, проточный цитофлуориметр FACScan.. Полученные результаты: В результате проведенной работы был осуществлен биоинформационный анализ предсказанных и аннотированных промоторных областей гена RUNX1. Определены нуклеотидные последовательности двух аннотированных промоторных областей, разработаны праймеры с сайтами рестрикции для дальнейшего клонирования данных промоторных областей. Проведена амплификация промотора P1 и его клонирование в промежуточном векторе с последующим переносом данной промоторной области в лентивирусный вектор перед репортерным геном красного флуоресцирующего белка mCherry. Разработаны конструкции генов анти-RUNX1, анти-RUNX1T1 и анти-RUNX1/ RUNX1T1 коротких шпилечных РНК и олигонуклеотиды для синтеза соответствующих конструкций. Синтезированные фрагменты ДНК клонированы в составе лентивирусного вектора, содержащего репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка eGFP. Полученные вектора были использованы для модификации клеток, а результаты оценивались посредством проточной цитофлуориметрии и количественной ПЦР. Показано, что уровень экспрессии репортерного эпигена mCherry, находящегося под регуляцией промотора P1 гена RUNX1, не различается в клетках, продуцирующих анти-RUNX1T1 короткие шпилечные РНК по сравнению с контрольными клетками, не продуцирующими коротких шпилечных РНК. В то же время продукция в клетках анти-RUNX1 коротких шпилечных РНК понижает, а анти-RUNX1-RUNX1T1 коротких шпилечных РНК повышает экспрессию данного репортерного гена. Эти данные указывают на наличие у продуктов гена RUNX1 и гибридного онкогена RUNX1-RUNX1T1 регуляторной активности в отношении собственного промотора, причем характер этой регуляции имеет антагонистический характер. Области применения: клеточная молекулярная биология, онкогематология, экспериментальная генная терапия.