Создание генетической конструкции, несущей acdS-ген бактерий рода Pseudomonas, и анализ его экспрессии в клетках растений : отчет о научно-исследовательской работе (заключительный) / БГУ ; научный руководитель Е. А. Храмцова

Abstract

Объекты исследования - бактерии Pseudomonas putida B-37, Agrobacterium tumefaciens, растения Nicotiana tabacum. Цель работы - создание генетической конструкции, несущей acdS-ген бактерий рода Pseudomonas, и анализ его экспрессии в клетках растений. Методы НИР: микробиологические (культивирование микроорганизмов), генетические (трансформация), молекулярно-генетические (выделение ДНК, РНК, рестрикционный анализ, клонирование, ПЦР), биохимические (определение активности АЦК-дезаминазы). В процессе исследования были использованы следующие приборы: аппараты для проведения ПЦР, гель-электрофореза, анализа гелей, спектрофотометр, весы лабораторные аналитические, центрифуги, термостаты, холодильники, сушильные шкафы, автоклав, качалки, водяные бани. В результате acdS-ген бактерий P. putida B-37 был амплифицирован и клонирован в составе вектора pTZ57R/T в клетках Escherichia coli XL-1blue; определена первичная нуклеотидная последовательность этого гена и осуществлён её анализ in silico; на основе бинарного вектора pBI121 создана генетическая конструкция, несущая acdS-ген бактерий P. putida B-37, для клонирования целевого гена в растительных клетках; установлена транзиентная экспрессия гетерологичного гена в растительных клетках N. benthamiana; осуществлён перенос векторной конструкции pBI121acdS в клетки A. tumefaciens AGLO; проведена агробактериальная трансформация клеток растений табака методом листовых дисков; из трансформированной каллусной культуры получены растения-регенеранты; установлено, что в геноме растений-регенерантов N. tabacum содержится acdS-ген бактерий P. putidaB-37, подтвержден факт его экспрессии в растительной ткани; показано, что уровень экспрессии acdS-гена бактерий P. putida B-37 в одном из трансгенных растений N. tabacum был в 1,27 раз выше относительно референс-гена; установлено, что в трансгенных растениях, не испытывающих стрессовых воздействий, активность АЦК-дезаминазы составляла (4,32 [+ -] 0,18) нмоль/(ч·мг белка), что согласуется с литературными данными об удельной активности фермента в других трансгенных растениях.