Клонирование гена антимикробного пептида прудовой лягушки (Rana esculenta) и изучение особенностей его экспрессии в E. coli. ГПНИ «Фундаментальные основы биотехнологий», подпрограмма «Новые биотехнологии» : отчет о научно-исследовательской работе (заключительный) / БГУ ; научный руководитель В. А. Прокулевич

Abstract

Объектом исследования является нуклеотидная последовательность гена эскулентина-1b из базы данных GenBank Национального центра биотехнологической информации последовательностей (код доступа X77833). Цель работы – клонирование гена антимикробного пептида эскулентина и изучение особенностей его экспрессии в клетках бактерий E. coli в составе химерных генетических последовательностей, кодирующих фьюжн-белки. Основными методами исследования являются: биоинформатические, молекулярно-биологические, генетические и микробиологические. В процессе работы использовались следующие приборы: амплификатор, системы для проведения электорофореза нуклеиновых кислот и белков, центрифуги, термостатируемые перемешивающие бани, холодильники, лабораторные весы, аналитические весы, сухожаровые шкафы, автоклав, орбитальные термостатируемые шейкеры, система гель-документации, спектрофотометр, автоматический секвенатор. В результате работы разработаны праймеры для синтеза гена антимикробного пептида эскулентина-С, а также праймеры для получения химерных генетических последовательностей, включающих структурную часть гена эскулентина, сшитую с генами, детерминирующими синтез антивирусного (бычий альфа-интерферон) и антистафилококковых (эндолизин стафилококкового бактериофага К и его CHAP домен, а также эндолизин с гистидиновой меткой) белков. Химерные гены клонированы в составе стабильно наследуемых векторных систем бактерий E. coli, проведено их секвенирование и определена первичная последовательность соответствующих генов. Проведена индукция экспрессии всех клонированных генов в клетках бактерий штаммов E. сoli серии BL21 (E. сoli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL, E. coli BL21(DE3) и E. coli BL21(DE3)pLysS), в результате которой установлено внутриклеточное накопление только тех фьюжн-белков, в которых эскулентин находится на N-конце молекул, но в то же время выявлено, что экспрессия сопровождается падением оптической плотности культуры штамма-продуцента, обусловленным лизисом бактериальных клеток и постепенным востановлением параметров роста к окончанию индукции. Данные подтверждены определением числа жизнеспособных клеток штаммов-продуцентов фьюжн-белков. Также установлено, что самый высокий уровень экспрессии характерен для белка, в котором фьюжн-пертнером эскулентина выступает эндолизин стафилоккоккового бактериофага К, меченный гистидиновыми остатками, по размеру на порядок превосходящий эскулентин и эффективно формирующий тельца включения. Кроме того, штамм E. сoli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL как продуцент данного фьюжн-белка характеризуется наилучшими показателями роста культуры на протяжении индукции экспрессии гибридного гена. Турбидиметрически определено наличие антибактериальной активности фьюжн-белка, состоящего из эскулентина и эндолизина стафилококкового бактериофага К с гистидиновой меткой.