Белковая инженерия эффективной глифосатоксидазы : отчет о научно-исследовательской работе (заключительный) / БГУ ; научный руководитель Е. А. Николайчик

Abstract

Объектом настоящего исследования являлись бактерии Bacillus subtilis и растения табака Nicotiana tabacum. Целью работы является конструирование путем сайт-направленного мутагенеза гена глифосатоксидазы, способной эффективно функционировать в растениях и обеспечивать их устойчивость к гербициду глифосату. Работа выполнялась современными молекулярно-биологическими методами, включая ПЦР, молекулярное клонирование, мутагенез in vitro. Ключевым методическим подходом, наиболее критичным для выполнения работы, являлось введение путем последовательных раундов олигонуклеотид-направленного мутагенеза in vitro семи нуклеотидных замен в бактериальный ген глициноксидазы, что позволило изменить субстратспецифичность его продукта, радикально повысив сродство модифицированного фермента к глифосату. Основными результатами выполненной работы являются: Клонированы гены глициноксидазы (thiO) из трех штаммов B. subtilis. В нуклеотидную последовательность двух клонированных генов путем сайт-направленного мутагенеза введены замены нуклеотидов, что позволило заменить три аминокислотных остатка в составе кодируемых этими генами ферментов и модифицировать их субстратспецифичность. Полученные варианты глициноксидазы с тремя аминокислотными заменами активно окисляют глифосат и позволяют клеткам Escherichia coli расти на средах с высокой концентрацией этого гербицида. • Сконструированы два агробактериальных бинарных вектора с мутантными генами глифосатоксидазы, пригодные для трансформации растений. • Проведена трансформация растений с использованием сконструированных бинарных векторов. • Проверена устойчивость трансгенных растений к глифосату в стандартной рабочей концентрации. Растения, трансформированные одним из двух векторов, показали относительно высокий уровень устойчивости к гербициду. Таким образом, сконструированный путем сайт-направленного мутагенеза ген глифосатоксидазы является функциональным в растениях и может обеспечивать их устойчивость к глифосату.